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斑马鱼感染金黄色葡萄球菌的MicroRN
今天为大家带来的是今年发表在《FISHSHELLFISHIMMUNOLOGY》的一篇关于斑马鱼致病机理免疫应答方面的文章，篇名为《MicroRNAprofileofimmuneresponseingillsofzebrafish(Daniorerio)uponStaphylococcusaureusinfection》。
在鱼类中，鱼鳃具有巨大的粘膜表面，在对各类病原体的感染的免疫反应中起着关键作用。鱼鳃组织中不仅含有参与水分耗氧量、渗透压调节和毒理学反应，而且是一种重要的免疫组织。近几十年来，人们对基因在鱼鳃在病原体和污染物的胁迫下的表达进行了研究，并在不同水平上对鳃的免疫应答反应进行了探讨。在过去的研究表明，MicroRNAs（miRNAs）是鱼类鳃部组织中细菌感染免疫应答的关键调节因子。但是在急性病原体攻击中鱼类鳃中的miRNA表达谱的变化至今还没有被研究过，miRNA在革兰氏阴性菌的感染过程中的表达会如何变化及其表达机制仍然是未知的，这种免疫反应可能涉及的基因和通路仍有待于识别和分析。本篇文章为了进一步探讨革兰氏阴性菌感染致病胁迫鱼鳃miRNAs的免疫作用，通过利用金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，简称SA）诱导成年斑马鱼进行了研究。
miRNAs是一组内源性非编码小RNA（约22bp），引导RNA诱导的沉默复合体（RISC），并通过与靶信使核糖核酸（mRNA）特异结合，从而抑制转录后基因表达或直接降解mRNA。已有的研究结果表明，miRNAs在鱼类中具有多种生物学功能，主要包括器官形成、发育、繁殖、渗透调节、代谢和免疫等。
在感染SA之前，实验用的斑马鱼利用停止投喂约5天，利用淡水清空消化系统中的食物残渣。随后将50条鱼平均分为两组，在两个相同条件水环境中分别处理（每个水环境各有25条鱼）。处理组25只斑马鱼分别进行腹腔注射注入30μl（3×cfu/ml）活SA-PBS悬浮液。另一组对照组只注射等量的无菌PBS。取样时每一时间点随机抽取5条，分别为SA感染后6、12、24和48h。最终对一个对照组和四个处理样本（处理后6、12、24和48h）的鳃组织进行无菌解剖，并分别放置在离心管中。这五种混合鳃样本被储存在?80℃的超低温冰箱中。随后进行测序及结果分析。
实验结果：
（1）斑马鱼鳃SA处理后miRNAs表达谱
测序结果一共发现，PBS对照组和SA处理组之间有30个差异表达miRNAs（DEMs，differentiallyexpressedmiRNAs）。18个DEMs的表达水平被上调，而其余12个DEMs的表达水平被下调（表1）。
表1斑马鱼鳃SA处理前后差异DEMs
以往的研究表明，失去miR-家族减少了斑马鱼轴突生长和少突胶质细胞的数量。在本研究中，dre-miR-的表达水平在SA攻击后被发现下调，表明SA感染可能导致鱼类中枢神经系统发育的缺陷。此外，dre-miR-10a和dre-miR-的差异表达在三氯生处理的雄性幼斑马鱼中检测到。此外，dre-miR-a、dre-miR--3p和dre-miR-7a对乙醇刺激有表达影响，这三种miRNAs也出现在本研究的DEMs列表中。此外，纳巴霉素对斑马鱼胚胎中dre-miR-9和dre-miR-的表达有显著的诱导作用。dre-miR-参与了鱼类的发育，这是由于斑马鱼的胚胎缺陷，基因敲除或过度表达这种miRNA所造成的。dre-miR-34a在斑马鱼精子发生过程中的也起着调控作用。
在目前的研究中，dre-miR--3p的表达在斑马鱼鳃中的SA感染中降低。这种差异可归因于实验组织和刺激的差异。同时，在本研究中发现dre-miR-和dre-miR-34a参与斑马鱼鳃的抗菌免疫应答。有趣的是，本研究确认了miRNA-34家族的四名成员，并显示出不同的差异表达。两个DEMs（dre-miR-34a和dre-miR-34c-3p）被下调，而dre-miR-34b和dre-miR-34c-5p在响应SA感染时都被上调。这一结果表明，属于同一个miRNA家族的不同成员可能具有多样而复杂的免疫调节机制。本研究确定的DEMs是斑马鱼鳃抗菌免疫应答反应的重要因子，因为它们可能是一组有用的分子免疫标记物，可用于监测斑马鱼的免疫反应。
（2）靶基因的功能富集分析
通过GO富集分析，DEMs可能调控的靶基因在生物过程、细胞成分和分子功能这三个亚类中被富集了39个亚类（图1）。其中19个生物学过程主要与非特异性免疫反应、细胞死亡、生物学功能、信号转导、细胞过程和抗菌反应有关。此外，富集了11个主要涉及膜部分、分子复合物和细胞连接。
图1DEM靶基因丰富度的GO列表。这里列出的所有都具有明显差异(FDR0.05)。
同时，为了从信号系统的角度宏观上理解在SA感染下生物过程的变化，KEGG根据注释的信息在更高层次上实现了分类。
图2DEM靶基因丰富度的KEGG分类。X轴表示DEM目标基因的数目，而Y轴则是列出KEGG路径。
此外，DEMs通过KEGG富集分析发现29条信号通路对SA感染有显著的调节作用（表2）。这表明这些途径主要参与斑马鱼鳃的抗菌免疫应答，是了解斑马鱼鳃免疫分子机制的关键遗传因子。这些差异显著的信号通路主要与细胞凋亡、细菌疾病、抗菌免疫、癌症、非特异性免疫信号、应激反应、代谢信号和寄生虫病有关。
表2对照斑马鱼的鳃SA感染，DEM靶基因富集的主要免疫相关的KEGG通路列表。
值得注意的是，Th1andTh2celldifferentiation是典型的细胞免疫信号传导途径，这是巨噬细胞激活Th1细胞反应和抑制Th2细胞应答的重要途径。这里表明了Th1和Th2细胞对斑马鱼鳃的侵袭性SA感染有保护作用。这一结论得到了最近有关Th1细胞在小鼠SA感染中的作用的进一步证实。Toll-likereceptorsignalingpathway是识别病原体中保守结构的一种信号通路，它既能激活非特异性免疫反应，又能激活主要抗原特异性的适应性免疫；NF-kappaBsignalingpathway的激活是调节促炎细胞因子在非特异性免疫中表达的重要过程。此外，先天免疫系统是一种适应性免疫反应的激活物。近几十年来，鱼类的先天免疫系统和适应性免疫系统之间的这种联系已经被广泛的研究。很少有适应性免疫途径在表达上会变现被显著，这主要是由于本研究中SA感染持续时间较短所致。因此，建议在今后的研究中，需要进一步探讨与细菌感染有关的适应性免疫基因的表达变化。
（3）SA感染后关键免疫应答DEMs表达分析
SA感染信号通路非常丰富，利用生物信息学分析方法，共有9种DEMs被确认为这一信号通路的调控因子；为了应对斑马鱼鳃中的SA感染，其中4种DEMs被上调，5种被下调。在本研究中，调节SA感染途径的DEMs被确认为关键的SA应答miRNAs（基因集1，GS1）。此外，对GS1中DEMs的qRT-PCR分析表明，DEMs表达变化与qRT-PCR结果有密切的相关性（R值=0.，p0.01）（图3A）。在SA感染后的多个时间点上表达的SA免疫应答miRNAs的表达动态详细情况如图所示（图3B-J）。
图3免疫感染后鳃关键免疫应答反应miRNAs的qRT-PCR分析。（A）基于微阵列和qRT-PCR分析的相对表达变化之间的相关性，n=3。（B-J）在多个时间点对感染后9个关键的免疫应答miRNAs进行的表达分析。数据为平均±SD（n=6），与对照组相比，*p0.05，*p0.01；
结论
总之，本研究表明，SA感染改变了的miRNAs主要参与斑马鱼鳃抗菌免疫、细胞死亡、细胞免疫、细菌疾病、癌症、非特异性免疫和应激反应、信号转导以及翻译过程。此外，在斑马鱼鳃中发现了几条与抗菌免疫有关的重要途径。本篇文章有助于了解鱼类鳃免疫反应的分子机制。然而，由于对SA感染反应的免疫系统的复杂性和缺乏认识，已经获得了一些无法合理解释的结果，需要在今后的研究中进一步研究。
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