肺炎链球菌肺炎与先天免疫的研究进展

本文原载于《国际呼吸杂志》年第10期

肺炎链球菌属于革兰阳性细菌，一般成对排列，导致人体致病的主要成分是荚膜、脂磷壁酸(LTA)和链球菌溶素(PLY)。肺炎链球菌不仅是上呼吸道的常见定植菌，同时也是引起肺炎、脑膜炎和脓毒症等严重感染的主要原因[1]。由肺炎链球菌感染所致的社区获得性肺炎占所有肺炎中的比值超过25%。在年，五岁以下的儿童中有万患重症肺炎[2]。每年有将近万人死于肺炎链球菌感染，其中至少有万是儿童，造成了沉重的经济负担。当前所用的荚膜血清型疫苗的缺点和抗生素的耐药表明，肺炎链球菌在很长一段时间内仍然是一个重要的人类病原体[3]，同时使肺部慢性炎症性疾病如COPD中对肺炎链球菌的易感性增加，预计在年肺炎链球菌感染将成为第三个最常见的死亡原因[4]。

人类免疫系统主要分为先天免疫及后天免疫，包括一系列的防御机制如补体、黏膜清除、吞噬细胞、抗体和效应T细胞。宿主与肺炎链球菌的相互作用很复杂。在决定肺炎链球菌最终是被清除还是导致侵袭性疾病，以及在阻止和减慢感染的过程中，先天免疫都扮演着很重要的角色，并为后天免疫应答赢得时间。先天免疫通过模式识别分子(patternrecognitionreceptors，PRRs)识别微生物。在识别肺炎链球菌后PRRs调节炎症介质产生，促进炎症反应，活化急性期反应，聚集中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞，最终发展为后天免疫。本篇综述复习相关国外文献，总结了肺炎链球菌感染中先天免疫应答的最新研究进展。

1　补体

肺炎链球菌有一系列补体逃逸机制，所有引起侵袭性疾病的肺炎链球菌均包裹在荚膜内。多糖荚膜是主要的毒力因素，导致机体发病是因为荚膜不仅能保护肺炎链球菌免受补体介导的调理吞噬，而且能保护肺炎链球菌不被黏液和中性粒细胞网捕获。补体系统是机体先天免疫的基础组成部分，是机体抵抗不同病原体(包括肺炎链球菌)入侵的一道重要防线。补体活化主要通过三条不同途径：经典途径(theclassicalpathway，CP)、旁路途径(thealternativepathway，AP)及凝集素途径(thelectinpathway，LP)。不管何种途径激活，补体的主要作用是调理吞噬、激活中性粒细胞的趋化作用和形成攻膜复合物直接杀伤细菌。通过比较缺乏相应补体活化途径中关键成分的小鼠，我们发现经典途径是机体抵御肺炎链球菌感染的主要途径。敲除编码链球菌溶素的基因后，经典途径对肺炎链球菌的调理吞噬增强；在基因敲除的小鼠补体系统中，链球菌溶素对细菌毒力的影响减弱，表明远处释放毒素对补体的活化作用比毒素沉积在细菌表面的作用小[5]。补体缺陷加速了肺炎链球菌病的进展。补体缺陷的小鼠，鼻咽部感染肺炎链球菌后有60%发展成为脓毒症，表明补体能通过不依赖中性粒细胞的方式阻止肺炎链球菌定植发展为脓毒症[6]。血凝素是凝集素途径中的识别分子，缺乏血凝素的小鼠对肺炎链球菌易感性增加[7]。在补体对PLY的作用中，凝集素途径对人类补体的活化起重要作用。在缺乏经典途径的C1q-/-小鼠的血清中，完全没有C3沉积物形成。然而，在C1q-/-的人类血清中，C3活化物质的沉积对PLY有很强的调理作用。H因子是旁路途径中的一种补体抑制因子，肺炎链球菌表面蛋白中的胆碱结合蛋白(choline-bindingproteinA，CbpA)能聚集人类血清中的H因子到细菌表面。人类H因子结构域能紧密结合CbpAN形成复合晶体结构，该结构决定宿主特殊H因子的聚集。微生物蛋白能通过加强H因子19-20与C3b结合并下调补体活化。已知的肺炎链球菌表面蛋白有PspA、PspC和CbpA，它们通过减弱补体C3沉积和C3介导的吞噬作用抑制C反应蛋白与胞磷胆碱结合，以及通过结合C4b结合蛋白和H因子影响C3的沉积[8]。肺炎链球菌的细胞壁水解酶LytC和LytB在细菌扩散中的作用与C3沉积物逃避有关[9]。然而研究表明，烯醇酶(一种纤溶酶原结合蛋白)能结合人类C4b结合蛋白，抑制C3沉积，在小鼠中却不是如此[10]。最近新发现的能影响肺炎链球菌扩散的蛋白有唾液酸酶(NanA)，它能刺激中性粒细胞产生并释放促炎因子及细胞外陷阱产物[11]。

2　模式识别分子(patternrecognitionreceptor，PRR)

最初，肺炎链球菌被先天免疫中的不同感受器识别，我们称之为模式识别受体(PRRs)，它能影响大部分宿主的防御方式。PRRs包括Toll样受体(Toll-LikeReceptors，TLRs)，NOD样受体(NOD-LikeReceptors，NLRs)和多种细胞内DNA传感器。PRRs有共同的特征。首先，PRRs能识别微生物成分，我们称其为病原相关模式分子(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)。PAMPs是微生物生存的基础，难以发生变化。第二，不管是什么阶段，PRRs都以既定的形式在宿主中表达并识别病原体。第三，PRRs由遗传物质决定并在所有细胞上广泛表达的，不依赖于免疫记忆。

2.1　TLRs

TLRs在不同免疫细胞上表达，包括巨噬细胞，树突状细胞，B细胞，特殊类型T细胞，甚至是成纤维细胞、上皮细胞这样的非免疫细胞。TLRs不仅能识别细胞表面的病原体，而且能识别胞内溶酶体膜、核内体膜上的病原体。TLRs是PRRs家族中的一种，是先天免疫识别中的重要机制，对机体抵抗肺炎链球菌感染有重要的作用。在人体中TLR家族至少有10种，在小鼠中有13种。TLRs能识别PAMPs。根据他们的主要序列，TLRs能进一步分为几个亚家族，包括识别脂质的TLR1，TLR2，TLR6和识别核酸的TLR7，TLR8，TLR9。

革兰阳性菌的细胞壁成分能激活先天免疫。TLR2能识别不同的微生物成分，包括脂磷壁酸、脂蛋白及肽聚糖。在定植早期，TLR2可损伤上皮屏障的完整性，促进肺炎链球菌迁移。在TLR2-/-小鼠试验中，定植肺炎链球菌的清除率是降低的。与野生型相比，肺炎链球菌脑膜炎小鼠模型中，TLR2-/-增加了疾病严重性和细菌数量[12]。另外，在肺炎链球菌肺炎及脓毒血症的模型中，TLR2-/-小鼠易感性增加不明显，这可能是TLR4识别链球菌溶素起到了代偿作用[13]。此外，在肺炎链球菌肺炎中，TLR2-/-能明显减少IL-1β、IL-6和角质形成细胞(keratinocytecell，KC)的水平，同时也减少了中性粒细胞的迁移。老年人肺炎链球菌肺炎发病率增加，使严重疾病的病死率迅速增加。最近的数据表明，与幼鼠相比，老年鼠TLR的功能减退是病死率增加的重要原因。老年鼠肺部中TLR1，TLR2和TLR4蛋白水平降低，更易患肺炎链球菌肺炎；气管内感染肺炎链球菌后核因子κB(NF-κB)的活化及促炎因子的产生亦减少[14]；体外试验中，老年鼠在感染肺炎链球菌后，早期肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β和IL-6的产生随着年龄的增加而减少，这与肺泡巨噬细胞对肺炎链球菌细胞壁的识别及杀伤能力不足有关。TLR2信号的缺失与年龄相关的细胞因子作用下降有关。尽管与野生型小鼠相比，TLR2-/-小鼠对PLY缺乏型肺炎链球菌易感性增加，但是，TLR2-/-小鼠在感染野生型肺炎链球菌后，病死率并没有明显升高[13]。最后，在一个鼻咽部感染肺炎链球菌的体内试验模型中，肺炎链球菌中PLY结构不同，对TLR2的刺激也不同，这是导致毒力差异的关键[15]。除了诱导细胞因子，TLR2可能加强了白细胞对肺炎链球菌的吞噬作用及细胞内杀伤作用。白细胞对细菌脂蛋白的作用与TLR-2R和IL-1R相关激酶4(IL-1receptor-associatedkinase-4，IRAK-4)介导的炎症反应有关[16]。

TLR4的主要功能是识别革兰阴性菌细胞壁中脂多糖成分。一些公布的研究表明，TLR4能识别PLY，尽管这种相互交错的结构基础并不清楚。研究表明，不依赖TLR-4，PLY能活化先天免疫应答中的补体。鼻内滴注大剂量的PLY后，TLR4导致细胞因子、趋化因子如IL-6、IL-1β、KC产生及中性粒细胞聚[17]。在细菌定植早期及低剂量肺炎链球菌感染的体内试验中，TLR4-/-小鼠易感性、细菌负荷量和上呼吸道细胞凋亡增加[18]。然而一些研究认为在肺炎链球菌感染中，TLR4的作用是在细菌及PLY诱导的宿主细胞损伤后识别内源性配体。TLR4激动性抗体可以促进先天免疫。UT12是一种新的TLR4单克隆抗体。在给予UT12的小鼠模型中，UT12能抵抗流感病毒感染诱发的继发性肺炎链球菌肺炎，抑制炎症介质产生。UT12通过c-Jun氨基末端激酶和依赖转录因子NF-κB信号转导通路产生单核细胞趋化因子1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)，加快巨噬细胞在下呼吸道的聚集[19]。

TLR9表达在胞内器室膜上，能放大或调节吞噬作用。TLR9能识别胞质中肺炎链球菌非甲基化CpGDNA。由于缺乏衔接蛋白髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor，MyD88)，在肺炎链球菌脑膜炎及脓毒症小鼠模型中，TLR9-/-小鼠对肺炎链球菌高度易感，表明表型相关能增加病死率，减少细胞因子及趋化因子产物，增加肺部细菌负荷量及促进细菌在血液中的传播[19]。除了诱导细胞因子，TLR9也能增强白细胞内的杀伤作用。在体内外试验中，肺炎链球菌能诱导IL-10和Krupple样因子4(Krupplelikefactors4，KLF4)在小鼠肺部和人类肺上皮细胞中的表达。KLF4由细菌DNA-TLR9-Src-依赖的方式诱导产生，调节IL-10产生并控制炎症反应[20]。

TLR1、TLR6与先天免疫有关，尽管它们的重要性还没有得到实验证明。TLR2与TLR1、TLR6在结构与功能上的相互作用，与区别脂蛋白中脂质成分的细微变化有关。TLR2/6与TLR9的协同交互作用使小鼠对肺部感染产生有力抵抗。TLR2/6与TLR9配体能在机体抵抗革兰阳性菌及革兰阴性菌致命毒力作用中起强有力的作用[21]。TLR信号通路：TLRs与微生物成分接触后触发下游信号活化，使基因诱导参与宿主抗菌防御中。与相应配体结合后，TLRs经过构象变化形成二聚体。构象变化需要TIR域的接受子蛋白(TIRdomain-containingadapotrprotein，TIRAP)与Toll-IL-1受体(Toll-IL-1receptor，TIR)聚合。TLR有4种连接分子，分别为MyD88、TIRAP、TRAM、TRIF，它们能触发信号传导，活化转录因子NF-κB和(或)干扰素调节因子3/7(interferonregulatoryfactor3/7，IRF3/7)。重要的是，MyD88、TRIF活化不同的信号通路，产生促炎因子和干扰素-α(INF-α)。同时，MyD88激活信号传导通路下游的IL-1和IL-18受体。

2.2　NLRs

NLRs是细胞内PRRs，能识别胞内微生物产物并产生相应应答反应。人类NLR家族中主要有22种胞内蛋白，而小鼠中则至少有33种。NOD1和NOD2都含有N末端的CARD结构域，主要活化NF-κB依赖促炎基因的表达。NOD2被几乎所有细菌的基础物质肽聚糖活化，NOD1主要识别革兰阴性菌产生的肽聚糖碎片。NOD1-/-小鼠患肺炎链球菌脓毒症的易感性增高，是因为NOD1具有识别肠道菌群的作用而启动先天性免疫系统[22]。肺炎链球菌被NOD2识别，介导产生MCP-1，使巨噬细胞在上呼吸道聚集。NOD2和TLR2共同参与定植肺炎链球菌的清除。NOD2在肺炎链球菌脑膜炎中也有重要的作用。肺炎链球菌脑膜炎的体外实验中，NOD2-/-小鼠显示星形胶质细胞增生，脱髓鞘及炎症反应轻。然而，细菌清除可能还需要其他细胞的参与，如在抗原提成细胞中由NOD2和TLR2结合起来的Th17[23]。NOD2-/-的体外肺炎链球菌感染中，小胶质细胞和星形胶质细胞产生的肿瘤坏死因子α(TNF-α)，IL-6和巨噬细胞炎症蛋白1α(macrophageinflammatoryprotein-1α，MIP-1α)减少。在体内NOD2识别细胞内肺炎链球菌后活化NF-κB，这在中枢神经系统在产生和促进炎症过程中起重要作用[24]。

其他能识别肺炎链球菌的NLRs为炎症小体形成蛋白NLRP3。最近的研究表明NLRP3炎症小体与PLY刺激巨噬细胞及树突状细胞产生IL-1β有关[25,26]。NLRP3能调控肺部细菌的清除[25]和维持肺上皮细胞/内皮细胞屏障[26]。这些研究表明，NLRP3-/-老鼠对肺炎链球菌肺炎易感性增加。与野生型相比，缺乏一种叫凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD，ASC)的连接蛋白，NLRP3-/-小鼠对肺炎链球菌的易感性增加。易感性增加表明无论依赖ASC而不依赖于NLRP3或是不依赖ASC的功能有关[27]。NAIP5是一种包含BIR结构域的NOD-LRR蛋白，与对细胞内病原体军团菌易感性有关[28]。尽管NAIP5被假设为军团菌的一种胞内感受器，NAIP5的特殊配体及信号通路有待研究。

3　其他蛋白及受体

3.1　SIGN-R1(specificintercellularadhesionmolecule-3-grabbingnonintegrin-related1)

SIGN-R1由巨噬细胞表达，能与血清型不同的肺炎链球菌荚膜多糖结合并促进其摄取。SIGN-R1基因敲除的小鼠对肺炎链球菌的易感性增加，说明了SIGN-R1识别作用的重要性[29]。SIGN-R1缺乏降低了抵抗肺炎链球菌感染的天然抗体的水平，同时阻碍宿主防御。最终SIGN-R1结合C1q，活化经典途径，促进补体在SIGN-R1的分布并限制肺炎链球菌[30]。

3.2　清道夫受体、MARCO和CD36

清道夫受体(scavengerreceptor，SR)是一个庞大多样的表面糖蛋白家族，主要表达在巨噬细胞、树突状细胞及内皮细胞上。胶原样结构巨噬细胞受体(themacrophagereceptorwithcollagenousstructure，MARCO)最需要TLR2和NOD2依赖的NF-κB活化信号来清除病原体入侵。MARCO-/-小鼠清除鼻咽部肺炎链球菌的能力严重受损。MARCO缺乏不仅损害清除细菌的能力，在肺炎链球菌定植后，小鼠产生细胞因子和使细胞聚集到鼻咽部的能力亦受损。此外，在肺炎链球菌肺炎中，MARCO-/-小鼠内由巨噬细胞产生的细胞因子及趋化因子减少，其中包括INF-α[31]。尽管肺炎链球菌的特征至今认识不清，但清道夫受体A(scavengerreceptor，SRA)和MARCO都能与其结合，小鼠缺乏其相应受体都会增加肺炎链球菌肺炎的易感性。CD36是表达在肺泡巨噬细胞和呼吸道上皮细胞上的B类清道夫受体，同时也是TLR2的共受体，在金黄色葡萄球菌感染中起一定作用。与同窝出生野生型幼畜相比，CD36-/-小鼠在感染早期炎症反应扩大。在肺炎链球菌感染中，CD36能充当吞噬细胞的受体，调节早期先天免疫，最终增强肺部宿主免疫反应[32]。

3.3　髓样细胞触发受体1(triggeringreceptorexpressedonmyeloidcells-1，TREM-1)

TREM-1表达在巨噬细胞表面，能提高宿主在肺炎链球菌肺炎中的抵抗力，参与改变肺炎链球菌诱导白介素-1受体相关激酶-M(IL-1receptor-associatedkinase-M，IRAK-M)过程，促进肺炎好转，显著加快细菌的清除和提高生存率[33]，增强肺泡巨噬细胞的早期免疫反应。随着肺炎链球菌在原位感染的增强和向远处脏器的扩散，TREM1/3缺乏导致病死率增加。在鉴别菌血症方面，sTREM-1在入院患者血清中的标准比临床病情多变的患者中要更精确。

4　细胞

4.1　非常规T淋巴细胞

非常规T淋巴细胞分布在黏膜表面，像哨兵一样监视是否有病原体入侵，其中包括黏膜相关恒定T细胞(MAIT细胞)，γδT细胞和自然杀伤T细胞(NKT细胞)。它们保留细胞原有的特点，能够通过识别既有的、应激诱导的以及微生物配体被迅速激活。在人类中，MAIT细胞占末梢循环中T细胞总数的1%～10%。同时在肝脏及黏膜组织中也有发现，包括肠(固有层)及肺。肺炎链球菌可能产生MR1(MHC-relatedmolecule1)配体活化MAIT细胞，产生IFN-γ和L-17参与肺炎链球菌的早期识别。IFN-γ和IL-17是重要的T细胞辅助因子，能在早期控制肺炎链球菌感染。在老鼠中，γδT[34]细胞和NKT细胞通过Th1和/或Th17产生相关细胞因子，在肺炎链球菌免疫中起关键作用。γδT细胞在肺炎链球菌感染中潜在作用的研究仅限于动物模型。与野生型鼠相比，缺乏γδT细胞的小鼠，肺部细菌负荷量更高、生存率更低。γδT细胞缺乏同样与MIP-2，TNF-γ和IL-17的分泌减少及中性粒细胞聚集有关。

一些研究重点强调了NKT细胞在宿主抵抗肺炎链球菌中的重要性。与野生型相比，当感染肺炎链球菌(血清3型)时，NKT细胞缺乏的小鼠病死率和肺部细菌负荷量增加。缺乏NKT细胞，MIP-2分泌减少，早期中性粒细胞聚集受到损害。目前已证实，NKT细胞产生IFN-γ对预防肺炎链球菌肺炎有重要作用。NKT细胞是早期清除肺炎链球菌的重要效应细胞。在肺炎链球菌(血清型1和3)感染的自然过程中，小鼠NKT细胞能产生IFN-γ和(更低程度)IL-17，这个发现说明了IFN-γ，IL-17和中性粒细胞(不是肺泡巨噬细胞)在肺炎链球菌清除中起关键作用。目前研究仅限于动物实验，还没有相关NγδT细胞和NKT细胞在人类肺炎链球菌感染中作用的研究报道。

4.2　肺泡上皮细胞

肺泡上皮细胞参与肺部炎症，但是其在炎症中的特殊作用没有得到定义。最近的一项研究表明I型肺泡上皮细胞能影响先天免疫反应。在肺炎链球菌肺炎中，上皮细胞能依赖NF-κBRelA表达多种中性粒细胞刺激因子。但是在一个小鼠上皮细胞RelA突变的模型中，I型细胞诱导细胞转录因子CXCL5并不需要RelA。在肺炎链球菌肺炎中，通过CXCL5和粒巨噬细胞集落刺激因子，肺泡上皮细胞能迅速聚集中性粒细胞，这表明在细菌感染中先天免疫作用增强，在肺炎中RelA不依赖先天免疫基因诱导的任何途径。

5　小结

机体对肺炎链球菌的免疫应答很复杂。因为篇幅有限很多方面没有讨论到。TLRs系统与NLRs之间的关系，以及不依赖TLRs活化后天免疫的详细机制，仍有待研究。需要进一步的研究去说明的是，抵御微生物的免疫反应，需要不同受体之间相互作用，才能保持肺炎链球菌的充分清除、有限的机体损伤、PRRs及细胞因子之间的交互作用及调节。此外，免疫细胞之间的互相作用对体内细菌的快速清除起重要作用。

参考文献

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