群感效应在金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌群

主办单位：南京工业大学

协办单位：中国生物工程学会

协办单位：中国化工学会生物化工专业委员会

ISSN：-CN：32-/Q

群感效应在金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌群体增殖中的作用

徐振波1，2，刘子奇1，谢金红1，刘君彦1(1.华南理工大学食品科学与工程学院；2.马里兰大学微生物病理系)

摘要

群感效应(quorumsensing，QS)是指微生物细胞通过感应细胞外信号分子的浓度从而感知菌群密度的大小，并依赖信号分子的浓度来调控基因表达的一种交流机制。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分别是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中典型的食源性致病菌，二者的QS系统在不同情况下的群体增殖中表现出竞争和协同作用，与毒素分泌、耐药性及被膜形成相关。本文中，笔者分别介绍了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的群感效应系统，并概述了群感效应在两种微生物群体增殖中的作用，由于多种微生物种间关系调控和交流机制较为复杂，对两种微生物群体增殖特性和相互作用机制有待进一步研究。关键词：金黄色葡萄球菌；铜绿假单胞菌；群感效应；食源性致病菌；耐药性；生物被膜

群感效应(quorumsensing，QS)是微生物通过感知自体诱导物(autoinducer，AI)的浓度来调节相关基因表达的一种作用机制，也是微生物间进行相互交流的一种通讯方式[1-2]。年，人们在对海洋生物发光系统的研究中发现了费氏弧菌(Vibriofischeri)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)中的QS[3-4]。年，Fuqua等[5]报道了LuxI/LuxR系统在不同细菌物种群感效应中的调节作用，人们对QS在细胞间通信的调控原理和过程逐渐明晰。近年来，我国对食品行业的安全性要求越来越高，由食源性致病微生物引起的食物中毒事件时有发生。金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性菌，广泛存在于空气、土壤、水源、人和动物体内，在我国，约有20%～25%的食物中毒由金黄色葡萄球菌引起，仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌。铜绿假单胞菌属于非发酵革兰氏阴性菌，广泛存在于湿润环境，尽管铜绿假单胞菌不作为食品微生物检测的常规指标项目，但已经被确认为食源性和水源性致病微生物。金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌已被证实可以共同污染水源以及肉制品、乳制品等食品行业，多微生物相互作用成为食品行业的巨大隐患。QS不仅有助于细菌间相互交流和种群密度调控，而且在维持细菌对人类等其他宿主的致病性方面也发挥着重要作用[6]。为了治理金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌引起的混合污染，必须先了解两者的群体增殖特性和相互作用机制。

1金黄色葡萄球菌群感效应系统

在金黄色葡萄球菌中至少有两个QS系统，分别为agr(theaccessorygeneregulator，agr)系统(图1)和LuxS/AI-2系统[7]。agr系统是革兰氏阳性菌中典型的QS系统，也是金黄色葡萄球菌中起到主导地位的QS系统，而LuxS/AI-2系统在革兰氏阴性菌和阳性菌中均广泛存在，在金黄色葡萄球菌中和主要的群体感应系统一起共同参与基因的调控。

图1金黄色葡萄球菌QSagr系统示意[8]Fig.1S.aureusquorumsensingagrsystemmodel[8]

通常在指数期后期，随着种群密度增加，金黄色葡萄球菌中信号分子自体诱导肽(AIP)不断积累，agr系统被诱导[7]。根据AIP不同，agr主要分为Ⅰ～Ⅳ基因型。AIP与位于细胞膜上的受体蛋白结合后，通过受体蛋白与其他蛋白作用调控种群密度、胞外物质和毒素分泌等相关基因的表达。P2和P3是agr系统中的两个反向启动子[9]，分别调控RNAII和RNAIII的转录。RNAII编码区由agrA、B、C和D4个基因组成[10-11]。agrD与AIP前体的合成有关，而后由agrB编码细胞膜上的跨膜肽链内切酶对AIP前体进行诱导、修饰和转运。agrC和agrA编码的AgrC(转膜受体组氨酸激酶)和AgrA(细胞质调控子)组成二元传导系统，AIP结合到传感器AgrC，促使AgrA磷酸化后，与P2和P3启动子结合调节RNAII和RNAIII表达[12-13]。

RNAIII是调控靶基因表达的重要分子[14]，目前RNAIII已被证实不仅可以抑制多种表面蛋白的表达，如葡萄球菌表面蛋白A(SpA)、纤维连结蛋白A和蛋白B(FnBPA和FnBPB)，同时也可以促进多种毒力蛋白的表达，如δ-溶血素(Hld)、α-溶血素(Hla)、杀白细胞素(PVL)等[12-13,15]。RNAIII的结构模型可被划分为3个主要的结构域：5′端结构域、中央结构域和3′端结构域。中央结构域可能会经历特异的构象变化，而5′端结构域和3′端结构域分别与RNAIII的稳定性和调控蛋白A的表达密切相关。没有重叠的5′端结构域和3′端结构域可以与α-溶血素mRNA折叠成非编码的构象前端互补，独立地促进α-溶血素的表达[11]。

2铜绿假单胞菌群感效应系统

在铜绿假单胞菌中主要有4个QS系统，分别是LasI/LasR系统、RhlI/RhlR系统[16]、喹诺酮类信号(PQS)系统[17]和集成群体感应信号(IQS)系统。LasI/LasR系统和RhlI/RhlR系统属于革兰氏阴性菌中的LuxI/LuxR系统[18]，其信号分子是高丝氨酸内脂(AHL)。lasI和lasR分别编码高丝氨酸内脂同系物OdDHL(N-(3-oxododecanoyl)-homoserinelactone)及其转录激活因子，rhlI和rhlR则负责编码BHL(N-butyrylhomoserinelactone)合成酶及其转录激活因子。当信号分子随菌群数量累积到阈值时，LasR-OdDHL和RhlR-BHL二聚体结合到保守的las-rhl区域从而启动下游毒素蛋白表达[12,18-20]。

目前已知有蛋白酶(lasB、lasA、aprA)[21-22]、外毒素A(toxA)[23]、绿脓菌素(phzABCDEFG)[24]、鼠李糖脂(rhlAB)[25]、凝集素(lecA)[26]和氢氰酸(hcnABC)[27]等毒素因子受LasI/LasR系统和RhlI/RhlR系统调控。RNA-seq分析表明，在铜绿假单胞菌中，LasI/LasR系统和RhlI/RhlR系统同时或单独控制了约10%的基因表达[28]，与QS有关的毒素因子大部分受RhlI/RhlR系统激活[12]。

PQS系统的信号分子是2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(PQS)，Pesci等[29]发现野生型铜绿假单胞菌PAO1的上清液能诱导lasR缺陷株中lasB表达，这证明了PQS系统的存在。pqs操纵子(pqsABCD)、phnAB和pqsH共同参与了PQS的合成[30-31]。首先PqsA活化邻氨基苯甲酸形成邻氨基苯酰-辅酶A，随后邻氨基苯甲酸在PqsBCD作用下转化为PQS的前体2-庚基-4-喹诺酮(HHQ)[32]。HHQ可以在PqsH作用下转化为PQS，也可以在PqsL作用下转化为N-氧化物，以4-羟基-2-庚喹诺酮-N-氧化物(HQNO)最为常见(图2)。pqs操纵子启动区域的表达受LasI/LasR系统调控[2,32-33]，也能被PqsR转录调控因子的直接结合而控制。目前已知绿脓菌素(PhzABCDEFG)、弹性蛋白酶(LasB)、PA-IL凝集素(LecA)和鼠李糖脂(RhlAB)、氢氰酸[34-36]等毒素的生成与PQS系统的控制有关。在囊性纤维化病人的痰液、支气管肺泡液和脓液中，常检出PQS和其前体物质HHQ和衍生物HQNO，因此推测三者具有相似的致毒和感染功能。

图2喹诺酮类QS系统信号分子合成示意图Fig.2Thesignalmoleculesinquinolonesignalssystem

年，Lee等[37]报道了一个新的QS系统——IQS系统。abmBCDE基因簇编码信号分子IQS的产生，当IQS与对应的受体IqsR结合时，启动IQS系统。他们还发现，抗代谢物L-2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸(AMB)的合成与IQS系统有关，通过敲除ambB、PQS合酶基因pqsA或C4HSL合酶基因rhlI后，只能分别通过添加PQS和C4HSL来恢复ΔpqsA和ΔrhlI中的AMB的合成，而不能通过添加IQS来恢复。这些发现表明，AMB的生物合成受IQS通过RhlI/RhlR系统和PQS系统的调控，这与其他毒力特性(如产黄素)相似[37]。该系统不仅可以监测细菌种群密度，而且还可以承载磷酸盐限制的胁迫。

铜绿假单胞菌的QS系统相互作用，形成了复杂而精细的级联调控关系(图3)。LasI/LasR系统位于级联调控系统的顶端，在铜绿假单胞菌种群数量达到阈值时[18,38]，形成的LasR-OdDHL复合物能激发RhlI/RhlR系统和PQS系统，从而显现出逐步激活层级系统的特点[39]。RhlI/RhlR系统和PQS系统受LasI/LasR系统调控的同时，也存在相互调控，PQS系统促进RhlI/RhlR系统表达，但PQS的合成受RhlI/RhlR系统抑制。RhlR-BHL复合物不仅能正调控其本身，同时能反过来正调控LasI/LasR系统[20]。PQS系统对LasI/LasR系统的表达也有促进作用。IQS系统上连LasI/LasR系统，下接RhlI/RhlR及PQS系统。正常状态下，IQS系统受LasI/LasR系统紧密调控，但当细菌处于磷酸盐缺乏的环境中时，IQS系统被激活，部分代替LasI/LasR系统的功能来调节毒力因子的产生。IQS系统生物合成的中断会使RhlI/RhlR及PQS系统麻痹，并减弱细菌的毒力。

图3铜绿假单胞菌层级QS系统[6]Fig.3SchematicrepresentationofthefourQS

signalingnetworksinP.aeruginosa[6]

3金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌群体增殖中的群感效应

金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的混合感染易引起食源性疾病的爆发，同时也是引起囊性纤维化患者感染肺炎、慢性肺炎或造成慢性伤口感染的主要原因[40-41]，两种微生物之间的相互作用会影响抗菌治疗的功效，故受到人们的广泛

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