MALDITOFMS在临床微生物鉴定

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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry,MALDI-TOFMS）技术，简称飞行质谱技术，是近年来临床微生物鉴定领域最具代表性的技术之一。每种微生物都由自身独特的肽/蛋白质组成，通过MALDI-TOFMS检测微生物的肽/蛋白质指纹图谱，经软件处理并与微生物数据库进行比对分析，可在几分钟之内完成对微生物种、属水平的鉴定[1,2]。与传统的检测微生物表型和生理生化方法相比，MALDI-TOFMS具有快速、准确、高通量、和低成本的优势[3,4]。除了可鉴定常见细菌和酵母样真菌[5]，更极大提高了临床微生物实验室对苛养菌、厌氧菌、丝状真菌以及分枝杆菌等难鉴定微生物的鉴定效率和能力[6,7,8,9,10,11,12]。对MALDI-TOFMS系统开发耐药性分析、细菌同源性分析及阳性血培养、无菌体液细菌直接鉴定等工作尚处在科研阶段[13,14,15,16,17,18,19]，随着研究的成熟和标准化的实现，有望逐步从研究走入临床应用。

配备MALDI-TOFMS仪器的实验室越来越多，飞行质谱仪的操作看似简单，但在临床应用阶段时常存在由于操作不够规范而导致鉴定结果出现问题的情况，因此飞行质谱的操作使用，包括样品选择、前处理流程、鉴定流程、报告原则及审核、解释和错误排查、质量控制、生物安全及仪器日常维护等仍有待于实现进一步的标准化。本共识旨在强调规范操作，提升使用MALDI-TOFMS的鉴定水平，提高临床工作中的质量和效率，并不涉及其科研方面的应用内容。目前，进口和国产的微生物MALDI-TOFMS均有上市，除特别标注外，本共识所涉及的标准化内容适用于所有的微生物MALDI-TOFMS系统。

MALDI-TOFMS质谱仪目前尚不能用于对临床标本和混合培养物的直接检测，分析对象必须是分纯的微生物，其对微生物的高准确性及可重复性鉴定是基于对微生物核糖体蛋白（相对分子质量~0）的检测，这是一类在微生物胞内固定表达的高丰度蛋白，因此，理论上不同的培养条件不会导致MALDI-TOFMS的鉴定结果的明显差异[3,20]。但是为了达到更理想的鉴定结果，实验室应尽量选择不会干扰鉴定的培养条件。

（一）固体与液体培养基

对于同一种微生物而言，尽管固体培养基和液体培养基获得的图谱可能存在一定的差异，鉴定结果并不受影响[4]。但对于常规鉴定来说，临床样本的培养应使用固体培养基，以获得单一的纯菌落进行鉴定。如果使用液体培养基，则必须保证培养物的纯度，并且需要在分析前进行富集及洗涤操作[4]。对这类特殊样本可根据厂家建议选择液体培养基，通过离心、清洗等步骤后进行质谱鉴定[12,21]。

（二）选择性与非选择性培养基

使用选择性或非选择性培养基通常不会影响MALDI-TOFMS鉴定结果的准确性[22,23]。针对同一株细菌而言，某些选择性培养基对于获取的图谱质量可能产生不良影响，导致低分值鉴定或无鉴定结果[20]，建议实验室尽量选择非选择性培养基进行细菌培养。

（三）培养条件和时间

MALDI-TOFMS鉴定细菌通常需要~菌落形成单位（CFU）的菌量。通常孵育温度、气体环境等不同的培养条件不会对MALDI-TOFMS检测的图谱质量及鉴定准确性产生影响[20,24,25]。建议以获得足够的新鲜培养物为目的，用最适培养条件对微生物进行培养，并使用足量、新鲜的培养物进行鉴定。

通常情况下，细菌和酵母样真菌培养18~24h即可获得用于MALDI-TOFMS鉴定的足够生物量（核糖体蛋白）[20,25]；某些厌氧菌需要将培养时间延长至72h[26]；丝状真菌应培养至生长出明显菌丝，产孢前或刚产孢时进行鉴定为最佳[6,27]，避免难破壁的孢子或色素的干扰；不同类型的分枝杆菌培养时间不同，多数快生长分枝杆菌培养时间7d即可得到肉眼可见的用于鉴定的菌落，而慢生长分枝杆菌则需要培养≥7d[28,29]。不同类型微生物孵育时间建议见表1。

表1不同类型微生物孵育时间

短时间的培养一般不会影响鉴定结果，但因不能确定是纯菌落，如果是混合生长则导致鉴定失败；对于产孢子的微生物，培养时间过长导致蛋白峰信号和图谱质量下降，降低了鉴定的可信度，这种情况需重新传代培养再鉴定[28]。

因临床需求，一些实验室采用短时间培养（6~8h）后刮取菌膜做质谱鉴定，该方法只能鉴定某些快生长细菌，不能可靠地鉴定所有微生物[30]，且无法鉴别是否为混合生长。短时间培养的鉴定结果只能发送初步报告，需注明"以最终的鉴定报告为准"。

（一）不同前处理方法的适用微生物范围及效果

MALDI-TOFMS鉴定的前处理步骤主要是通过破坏微生物的细胞结构，达到灭活微生物样本并提取胞内蛋白的目的。微生物细胞壁的结构和成分，是影响前处理效果的最重要的因素[31]，因此，样本破壁效果直接影响是否有足够的蛋白用于质谱的分析，是决定鉴定能否成功的前提。根据微生物的细胞壁结构和成分差异，可将MALDI-TOFMS微生物鉴定前处理方法分为五类[31,32,33,34,35,36]，其适用范围见表2，如果基础的提取方法不能达到预期的鉴定效果，则可以尝试使用更复杂的提取方法。具体在各个MALDI-TOFMS平台上的标准操作流程仍须由生产商进行验证并提供。

表2不同微生物适用的前处理方法及效果评价

（二）靶板涂布的注意事项

从培养基上挑取合适的菌量转移至靶板上相应的靶点位置，使用一次性接种环或无菌竹签轻轻涂抹，使菌苔在靶点上形成一层均匀的薄膜，应注意：涂抹的菌量太少，造成分析信号不足，导致鉴定失败；涂抹菌量过多或涂布不均匀，也可导致无法鉴定。在涂布时应尽量覆盖整个靶点区域，超出靶点区域易造成交叉污染[31]。

在涂布靶板时，还应特别

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