不常见细菌的快速鉴别方法

一.不常见革兰阴性菌

1.布氏杆菌属布氏杆菌属是一类革兰阴性细小杆菌，牛、羊、猪等动物最易感染。人类接触带菌动物或食用病畜及其乳制品，均可被感染。布氏杆菌病广泛分布世界各地，我国部分地区曾有流行。布氏杆菌属分为羊、牛、猪、鼠、绵羊及犬布氏杆菌6个种，20个生物型。中国流行的主要是羊、牛、猪三种布氏杆菌，其中以羊布氏杆菌病最为多见。布氏杆菌属细菌为非抗酸性，无芽胞，无荚膜，无鞭毛，呈球杆状(见图1)。血琼脂(BAP)上为透明或半透明、光滑且有光泽菌落。此细菌不在麦康凯琼脂上生长。布氏杆菌属细菌尿素阳性，触酶、氧化酶阳性，而吲哚阴性。由于该菌属细菌具有强的传染性，因此一旦怀疑应送往LRNB级参考实验室进行确认。

2.空肠弯曲菌空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因。其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症一格林一巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。空肠弯曲菌对红霉素、新霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等抗生素敏感，但近年发现了不少耐药菌株及多重耐药性菌株。

空肠弯曲菌菌体轻度弯曲似逗点状(见图2)。菌体一端或两端有鞭毛，运动活泼，在暗视野镜下观察似飞蝇。有荚膜，不形成芽胞。微需氧菌，在含2.5～5%氧和10%CO2的环境中生长最好，在正常大气或无氧环境中均不能生长，最适温度为37～42℃。本菌在普通培养基上难以生长，在凝固血清和血琼脂培养基上培养36小时可见无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则，无溶血现象。空肠弯曲生化反应不活泼，不发酵糖类，不分解尿素。可还原硝酸盐，氧化酶和触酶为阳性。能产生微量或不产生硫化氢，甲基红和v-p试验阴性，枸椽酸盐培养基中不生长,在弯曲菌中马尿酸呈阳性反应具有重要鉴定价值。

3.“HACEK”群细菌

HACEK是指一组革兰阴性杆菌：嗜血杆菌属(H)、放线杆菌属(A)、人心杆菌属(C)、艾肯菌属(E)、金氏杆菌属(K)。这组微生物的共同特征是易导致心内膜感染，约占全部感染性心内膜炎的5-10%，它们是导致正常人群(非静脉药物滥用者)心内膜炎的常见原因之一。所有这些微生物都是口咽部正常菌群的一部分，生长缓慢、喜好富二氧化碳环境。除心脏瓣膜感染，HACEK菌还导致其他感染：菌血症、各类脓肿、腹膜炎、中耳炎、结膜炎、肺炎、化脓性关节炎、骨髓炎、尿路感染、伤口感染、脑脓肿、牙周感染。

嗜血杆菌属因在生长过程中需含有生长因子X(氯化高铁血红素)和(或)V(辅酶Ⅰ)的血液琼脂而得名。本属细菌为革兰阴性小杆菌，无动力，具有明显的多型性，不形成芽胞，需氧或兼性厌氧。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属最重要的病原菌，镜下呈球杆状、长杆状、少数为丝状。粘液型菌株有荚膜，毒力较强。菌落一般为光滑型，若与金黄色葡萄球菌在BAP上共同孵育，则在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，这叫做“卫星现象”。原因是金黄色葡萄球菌能合成较多的V因子，促进流感嗜血杆菌的生长。

放线杆菌属为革兰阴性杆菌，有时呈球形、椭圆形(见图3)。兼性厌氧菌，无动力，无荚膜，在含血清或血液的培养基上生长良好，37℃培养2～3天后形成直径约1mm的菌落。在肉汤培养液中生长呈颗粒状。对人或动物致病的有伴放线放线杆菌、林氏放线杆菌和马驹放线杆菌。伴放线放线杆菌因常见于人类的某些放线菌病的病灶中而得名。但也可单独致病，如一些亚急性细菌性心内膜炎是由本菌引起的。本属细菌能还原硝酸盐，不产生吲哚，尿素阳性。

人心杆菌是心杆菌属内唯一的种，是人的鼻腔和咽喉部的正常菌群，可引起心内膜炎、尿路感染、脑脓肿和牙周炎等疾病。大部分菌株可从血液中分离而来，有的菌株也可从脑脊液中分离而来。人心杆菌为无鞭毛、无荚膜、无芽孢，并具有多形性的革兰阴性杆菌(见图4)。革兰染色不易被脱色，单个存在或成对排列，有时形成短链或呈葡萄状排列。该菌为兼性厌氧菌，某些菌株在初代分离时需要CO2，在生长过程中要有一定湿度，在干燥环境中不生长；在35～37℃均可生长，但在22℃或42℃均不生长。该菌在BAP上不溶血，经24h培养后菌落很小，48h后可达1mm，菌落为圆形、凸起、光滑、有光泽而边缘整齐，某些菌株的菌落可长入培养基中，使培养基表面琼脂凹陷。麦康凯琼脂上不生长。人心杆菌氧化酶阳性，触酶阴性，吲哚阳性，不还原硝酸盐。

啮蚀艾肯菌是革兰阴性多形性球杆菌(见图5)，有一种漂白剂的气味，兼性厌氧，是口腔和许多其他粘膜表面的正常菌群。啮蚀艾肯菌是人咬伤后发生的蜂窝织炎的病原体，它也是已发现静脉药物滥用者软组织感染和心内膜炎主要病原体。它也能导致各种各样的肺部感染(如脓胸、肺炎、败血症栓子)，类似严格偏性厌气菌。

大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎患者有潜在的生物瓣膜病变。与其他HACEK菌不同，大多数啮蚀艾肯菌性心内膜炎与静脉药物滥用有关。啮蚀艾肯菌在培养基上凹陷生长，吲哚阴性，鸟氨酸阳性。

金氏杆菌属是革兰阴性球杆菌(见图6)，有3个种：

金氏金氏杆菌、产吲哚金氏杆菌、去硝化金氏杆菌，只有金氏金氏杆菌引起心内膜炎。与其他HACEK菌不同，金氏杆菌感染进展相当迅速。金氏金氏杆菌在BAP呈大的、光滑、不透明、白色或米色、β-溶血菌落，与肠杆菌科细菌相似，但在麦康凯琼脂上不生长。金氏金氏杆菌触酶阴性，氧化酶阳性，通常分离自无菌组织和体液。4.土拉热弗朗西斯氏菌土拉热弗朗西斯氏菌简称土拉弗氏菌，是引起土拉弗氏菌病(野兔热)的病原菌。人类感染此病多因接触患病动物而致，或摄食污染食物和吸入污染空气所致。土拉杆菌是革兰阴性多形性细菌，镜下呈球状、杆状、豆状和丝状等，无芽胞、无动力、有荚膜。该菌营养要求较高，在普通琼脂培养基和肉汤中均不生长，只在加入胱氨酸、半胱氨酸、血液或卵黄的培养基中生长，形成圆形、光滑、灰色、凸起、有粘性的菌落，在鸡胚绒尿膜上也能生长，在卵黄囊中生长尤为茂盛，最适生长温度35℃～37℃。若从动物或人体初次分离，一般需要3—5天。常用培养基主要有半胱氨酸葡萄糖血液琼脂平板(Francis培养基)、卵黄琼脂平板和半胱氨酸巧克力琼脂。土拉热弗朗西斯氏菌氧化酶阴性，触酶阴性或弱阳性，β-内酰胺酶阳性。由于该菌具有强传染性，必须在生物安全柜中处理，一旦怀疑需送往LRN参考实验室进行确认。

5.卡他莫拉菌卡他莫拉菌为革兰阴性双球菌。过去一直认为卡他莫拉菌是对人体无致病性的上呼吸道正常寄居菌，但是，近20多年的研究发现，该菌不仅可以引起儿童和老年人的上呼吸道感染，而且还是引起成人下呼吸道感染的重要病原菌，是儿童上颌窦炎、中耳炎、肺炎以及成人的慢性下呼吸道感染的第3位最常见致病菌，仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。卡他莫拉菌在BAP上不溶血，整个菌落可推动，氧化酶、触酶阳性，丁酸盐、吲哚酚醋酸盐阳性。6.奈瑟菌属奈瑟菌属细菌为革兰阴性球菌，单个或成双排列，无芽孢、无鞭毛、有菌毛，触酶、氧化酶阳性，包括脑膜炎奈瑟菌(见图7)、淋病奈瑟菌等9种，其中有临床意义的致病菌为脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌。BAP上呈透亮不溶血菌落，氧化酶、γ-谷氨酰氨肽酶阳性为脑膜炎奈瑟菌。BAP上呈浅灰色不溶血菌落，氧化酶、β-半乳糖苷酶阳性为乳糖奈瑟菌。淋病奈瑟菌在巧克力琼脂上呈小的、有光泽的菌落，通常在BAP、MH和胰大豆琼脂上生长，氧化酶阳性，触酶强阳性(30%过氧化氢)，而γ-谷氨酰氨肽酶、β-半乳糖苷酶阴性。

不常见革兰阴性菌的快速鉴定方法

细菌名称

鉴定方法附加

确证试验

备注

布氏杆菌属

1．细小革兰阴性球杆菌2．氧化酶阳性3．触酶阳性4．麦康凯琼脂上不生长

1．尿素阳性2．吲哚阴性3．BAP上不溶血

强传染性，必须在生物安全柜中处理；通常分离自无菌组织和体液；需送往LRN参考实验室

空肠弯曲菌

1．革兰阴性杆菌，似海鸥翅膀状排列2．氧化酶阳性3．触酶阳性4．镜下穿梭样运动

1．马尿酸盐阳性2．吲哚酚醋酸盐阳性

分离自粪便标本有意义，42℃下在弯曲杆菌选择培养基上生长

人心杆菌

1．多形态的细小革兰阴性杆菌2．氧化酶阳性3．触酶阴性4．麦康凯琼脂上不生长

1．吲哚阳性2．不溶血

分离自血培养、CSF才有意义，硝酸盐阴性

啮蚀艾肯菌

1．细小革兰阴性杆菌2．CO2环境下在BAP或巧克力琼脂上菌落呈凹陷生长3．氧化酶阳性4．触酶阴性5．麦康凯琼脂上不生长

1．吲哚阴性2．不溶血3．特殊的漂白剂气味

如果菌落不典型，需用鸟氨酸阳性确认

土拉热弗朗西斯氏菌

1．细小革兰阴性杆菌或球杆菌2．氧化酶阴性3．触酶阴性或弱阳性4．巧克力琼脂上缓慢生长，BAP上不生长

β-内酰胺酶阳性

强传染性，必须在生物安全柜中处理；需送往LRN参考实验室

流感嗜血杆菌

1．革兰阴性球杆菌2．24h后在巧克力琼脂上生长，BAP或麦康凯琼脂上不生长

ALA阴性

如果必要，需做卫星试验与布氏杆菌属和弗朗西斯氏菌属鉴别

金氏金氏杆菌

1．革兰阴性球杆菌2．氧化酶阳性3．触酶阴性4．麦康凯琼脂上不生长

BAP上溶血

通常分离自无菌组织和体液

卡他莫拉菌

1．革兰阴性双球菌2．氧化酶阳性3．触酶阳性4．BAP上不溶血，整个菌落可推动

1．丁酸盐阳性2．吲哚酚醋酸盐阳性

脑膜炎奈瑟菌

1．革兰阴性双球菌2．氧化酶阳性3．BAP上呈透亮不溶血菌落

γ-谷氨酰氨肽酶阳性

强传染性，必须在生物安全柜中处理

乳糖奈瑟菌

1．革兰阴性双球菌2．氧化酶阳性3．BAP上呈浅灰色不溶血菌落

β-半乳糖苷酶阳性

淋病奈瑟菌

1．革兰阴性双球菌2．氧化酶阳性3．触酶强阳性(30%过氧化氢)

1．γ-谷氨酰氨肽酶阴性2．β-半乳糖苷酶阴性

淋球菌选择琼脂上生长

二.不常见革兰阳性菌

1．产单核李斯特菌李斯特菌是一种典型的胞内寄生的革兰阳性短杆菌，共分为2个群，7个种。第一群包括产单核细胞李斯特菌、伊氏李斯特菌、无害李斯特菌(又名英洛克李斯特菌)、韦氏李斯特菌及西尔李斯特菌；第二群为较少见的格氏李斯特菌和莫氏李斯特菌。其中产单核细胞李斯特菌和伊氏李斯特菌具有致病性，且产单核细胞李斯特菌是惟一能引起人类疾病的，是一种人兽共患病的病原菌，能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎、流产和单核细胞增多。这种病菌在自然界广泛存在，食品中存在的产单核细胞李斯特菌对人类的安全具有危险，世界卫生组织(WHO)指出，水产品、奶及奶制品、肉制品均有不同程度的污染，并曾将其列为20世纪90年代食品中四大致病菌之一。产单核李斯特菌是一种革兰阳性短小杆菌，通常成双排列，偶尔可见双球状(见图8)。有鞭毛，但仅在18~20℃有动力，在37℃动力缓慢。无芽胞，一般不形成荚膜，但在含有血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜。兼性厌氧，对营养要求不高，普通培养基上可生长，在血平板上会形成β-溶血。最适的生长温度是30~37℃，并可在4℃条件下进行冷增菌。本菌耐碱不耐酸，对热较为敏感，加热50℃10min即可死亡同时该菌对多种抗生素敏感，以氨苄青霉素为首选，尚有青霉素、链霉素、四环素、氯霉素和红霉素等敏感。但该菌对磺胺、杆菌肽和多粘菌素耐药。产单核李斯特菌触酶阳性，马尿酸盐阳性。2．链球菌属链球菌属细菌广泛分布于自然界、人和动物肠道、健康人鼻咽部等，致病链球菌可引起各种化脓性炎症、猩红热、风湿热等疾病。本属细菌为革兰阳性球菌，链状排列，无鞭毛，无芽孢，可形成荚膜，在液体培养基中易形成长链，致病性强的菌株多为长链，在脓汁标本中多为短链。本属细菌为需氧或兼性厌氧菌，部分为厌氧菌。营养要求较高，需在加有血液、血清等成分的培养基生长良好。根据链球菌在血液琼脂平板上菌落周围溶血情况，有草绿色溶血环的称为α型溶血，如草绿色链球菌；呈透明溶血环的称为β型溶血，称β溶血性链球菌或化脓性链球菌；也有不溶血的，称为γ型溶血，如肠球菌。根据族特异性抗原将链球菌分A－T18个族。链球菌属细菌触酶阴性。化脓链球菌(A群)PYR阳性。无乳链球菌(B群)马尿酸盐阳性，CAMP阳性。草绿色链球菌PYR阴性，LAP阳性，胆汁溶菌试验阴性。肺炎链球菌镜下为革兰阳性球菌，矛尖状，成双排列，在人和动物体内形成荚膜，菌落细小、周围有草绿色溶血环，48小时后，由于菌落自溶，呈现“脐窝状”，Optochin敏感试验阳性，胆汁溶菌试验阳性，菊糖分解试验阳性。

表2不常见革兰阳性菌快速鉴定方法

细菌名称

初步鉴定方法

附加确证试验

备注

路登葡萄球菌

1．革兰阳性球菌，葡萄状排列2．触酶阳性3．凝固酶试管法阴性

1．PYR阳性(深红色)2．多粘菌素B耐药3．鸟氨酸阳性

凝固酶玻片法可能阳性

浅绿气球菌

1．革兰阳性球菌，呈四联球菌或串状排列2．触酶阴性3．α-溶血

1．PYR阳性2．LAP阴性

产单核李斯特菌

1．细小革兰阳性杆菌2．触酶阳性3．BAP上窄的β-溶血环4．镜下通常翻滚样运动

马尿酸盐阳性

分离自血培养或CSF才有意义

无乳链球菌(B群)

1．革兰阳性球菌，成对或成链排列2．触酶阴性3．BAP上窄的β-溶血环

1．马尿酸盐阳性2．CAMP阳性3．兰氏血清分类法为B群

如果不溶血，不要做马尿酸盐试验

咽峡炎链球菌(米勒链球菌)

1．革兰阳性球菌，成对或成链排列2．触酶阴性3．BAP上菌落直径0.5mm，溶血不定

1．奶油或香草气味2．兰氏血清分类法为F群

兰氏血清分类法也可能为A、C、F或G群

化脓链球菌(A群)

1．革兰阳性球菌，成对或成链排列2．触酶阴性3．BAP上明显的β-溶血环，菌落直径0.5mm

1．PYR阳性2．兰氏血清分类法为A群

因为肠球菌也可能溶血，所以应该仔细观察菌落大小和溶血情况

草绿色链球菌

1．革兰阳性球菌，呈四联球菌或串状排列2．触酶阴性3．α-溶血或不溶血

1．PYR阴性2．LAP阳性3．如果α-溶血，胆汁溶菌试验阴性

如果镜下不成链状排列，片球菌属为万古霉素耐药，尿气球菌呈四联球菌，为尿路感染致病菌

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