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经典的RNA直接检测方法，如Northernblotting、FISH和微阵列等具有保真度高的优点，但往往费时费力，灵敏度低。基于核酸扩增(NAA)的RNA检测技术，包括逆转录PCR(RT-PCR)和其他等温扩增方法，可用于RNA的高灵敏度检测，但它们通常需要将RNA转换为DNA和模板复制步骤。因此，有必要开发通用的无扩增RNA诊断检测方法，既能获得类似PCR的灵敏度，又能避免NAA相关问题。最近在原核生物中发现的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)效应器Cas13a为RNA检测提供了更好的方法。作为RNA引导的RNA靶向效应器，Cas13a具有高度特异的靶标识别能力以及对附近报告分子进行切割的靶标依赖的反式切割活性，这使得在不逆转录的情况下直接检测RNA成为可能。单独使用Cas13a只能检测到亚pm浓度的RNA，灵敏度不足将阻碍其在aM水平上检测RNA靶标的应用。在没有NAA的帮助，体外(例如，在PCR试管中)很难检测到低浓度的mRNA分子。

该研究使用基于荧光探针的成像技术在细胞中显示mRNA分子，该关键因素是空间限制效应提高局部分子浓度，从而实现高效的反应或检测。基于这一前提，作者研究限制在细胞大小的体外Cas13a检测是否可以实现预期的结果，从而能够检测到每个细胞不到个拷贝的RNA。为验证这一想法，该研究通过液滴微流体在皮升大小的液滴中进行了Cas13a分析。经实验发现，来自单个RNA靶向激活的Cas13a的反式切割的累积荧光信号足以照亮一个皮升大小的液滴，从而使在单分子水平上进行无NAA和数字RNA定量成为可能。此外，作者还探索了此方法对临床血清中游离microRNA的精确计数、泌尿系统病原体16SrRNA的超灵敏检测以及在SARS-CoV-2的准确诊断中的适用性。

图1液滴化Cas13a检测原理图

(A)对局部浓度的限制效应。

(B)超定位Cas13a分析示意图。

(C)超定位Cas13a检测的步骤。

图2超定位Cas13a分析的定量性能

(A)在10倍物镜(比例尺：μm)下对皮升大小的液滴进行显影。

(B)液滴的尺寸分布。

(C)37°C孵育的单分子miRNA检测阳性液滴比例(PPD)的时间进程。

(D)通过液滴化Cas13a分析检测单分子miRNA时，阳性和阴性液滴之间的背景荧光差异。

(E)用于液滴化Cas13a分析的不同miRNA-17浓度的代表性终点荧光图像。

(F)液滴化Cas13a分析的线性范围。

(G)液滴化Cas13a分析和单管Cas13a分析的概念示意图。

(H)用分散Cas13a法测定合成的miRNA-17的定量范围。

图3使用液滴化Cas13a分析合成序列和癌症血清样本中miRNA

(A)利用与miRNA-17互补的crRNA检测来自不同家族的四个miRNA。

(B)四个同源mirna正交鉴定的热图分析。

(C)使用qRT-PCR、ddPCR和液滴化cas13a检测总miRNA提取物(10pg/μL)中miRNA-17的表达。

(D)通过液滴化cas13a法检测总miRNA提取物(10pg/μL)中miRNA-17的相对表达水平。

(E)使用液滴化cas13a检测方法对来自6名乳腺癌患者和5名健康捐赠者血清中的miRNA-21进行绝对定量。

(F)通过液滴化cas13a分析和qRT-PCR检测miRNA-21相对表达。

图SrRNA靶向液滴化Cas13a检测病原体

(A)使用液滴化Cas13a检测16SrRNA靶向病原体的原理图。

(B)PA的检测。用液滴化Cas13a法检测总RNA样品中的16SrRNA。

(C)鉴定一组泌尿病原体的物种特异性crRNA，包括铜绿假单胞菌(P.A.)、粪肠球菌(E.F.)、肺炎克雷伯氏菌(K.P.)、金黄色葡萄球菌(S.A.)和大肠埃希氏菌(E.C.)。

(D)五种泌尿病原体正交鉴定的热图分析。

图5SARS-CoV-2的液滴化Cas13a检测

(A)使用液滴化Cas13a试验进行SARS-CoV-2临床诊断的示意图。

(B)SARS-CoV-2基因组图，显示用于液滴化Cas13a分析的Orf1a(O)和核衣壳(N)基因区域。

(C)使用体外连续稀释合成的SARS-CoV-2RNA标准，通过检测N基因来评估液滴化Cas13a试验的量化能力。

(D)评估液滴化Cas13a检测的特异性。

(E)以N基因为靶点对SARS-CoV-2全长RNA进行定量。

(F)对SARS-CoV-2感染进行液滴化Cas13a检测的定量诊断。

这种液滴化的Cas13a检测方法，可作为实现单分子敏感性和消除NAA相关问题的一种替代方法。单个miRNA靶标激活的Cas13a的累积荧光信号足以照亮皮升大小的液滴，这一特征赋予了这种分析方法之前基于Cas13a的方法无法达到的性能：不含NAA的单分子检测和绝对数字定量。此外，Cas13a系统能为其他CRISPR-Cas系统(即Cas12和Cas14家族)提供一条简单和高灵敏的核酸检测途径。与其他的RNA检测技术相比，液滴化Cas13a检测方法在简单性和高灵敏度方面具有优势。例如，该方法是均相分析，从而避免了多相分析中所需的耗时的洗涤步骤。在灵敏度方面，该方法达到了单分子分析的灵敏度，是已报道的单分子荧光互相关光谱、纳米孔、SiMREPS和Miracles等方法的00倍；此外，该方法可以达到4个数量级的动态范围，覆盖了miRNA表达的自然动态范围；更重要的是，该方法对各种RNA分子(如miRNAs、细菌16srRNA和病毒基因组)的具有广泛适用性。该方法简单易行，单分子定量能力强，适用性广，有望成为下一代RNA诊断技术的候选方法。

周小明教授，华南师范大学，生命科学学院，分子生物医学实验室（建立者），研究员，博士生导师。其基于多学科背景，以交叉技术的角度开展生物、医学分子诊断方法和技术的开发和应用研究工作，研究内容主要概括为:“基因检测探针设计与构建、基因扩增方法、传感平台的研究及重大疾病核酸标志物、病原微生物的定性和定量检测应用”。研究成果在JACS,AngewandteChemie,NatureProtocols,NatureCommunications,ACSNano,ChemicalSocietyReviews,AnalyticalChemistry,Biomaterials,Theranostics,LabonaChip等期刊发表研究论文共计70多篇(截止目前被引用余次),HI指数31。获广东省杰出青年基金、广东省特支计划（科技创新青年拔尖人才)、广东省优秀青年教师基金等。

本文链接：AnUltralocalizedCas13aAssayEnablesUniversalandNucleicAcidAmplification-FreeSingle-MoleculeRNADiagnostics

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